A cultura de segurança nas instituições de saúde é aquela em que cada profissional reconhece suas responsabilidades frente à segurança do paciente e procura contribuir para melhoria na qualidade do cuidado. As organizações necessitam de culturas únicas, com fusão de valores, crenças e comportamentos que determinem a forma de seu funcionamento. Objetivo: Analisar a percepção dos profissionais de enfermagem acerca das dimensões da cultura de segurança do paciente em instituições de alta complexidade. Métodos: Trata-se de um estudo descritivo, transversal e com abordagem quantitativa. A população de estudo foi constituída por enfermeiros, técnicos e auxiliares de enfermagem que atuavam na assistência direta ao paciente, em três instituições de alta complexidade. A fim de avaliar a cultura de segurança do paciente, foi utilizado o questionário Hospital Survey on Patient Safety Culture (HSPSC), de 2004. A coleta de dados ocorreu entre fevereiro e abril de 2017, por meio de abordagem individual. Foi realizada análise descritiva, com uso de frequências absolutas e relativas. A cultura de segurança foi avaliada utilizando o cálculo dos percentuais de respostas positivas para cada dimensão do instrumento, à partir do cálculo dos percentuais foram atribuídas categorias, com a seguinte classificação: áreas consideradas fortalecidas (≥ 75,0% de respostas positivas), áreas com potencial de melhoria (<75,0% a >50,0%), e áreas enfraquecidas/fragilizadas (≤ 50,0%). Além disto, foi utilizando a análise de associação, por meio da regressão de Poisson com cálculo da Razão de Prevalência (RP) e Intervalo de Confiança 95% (IC 95%). Para análise dos dados utilizou-se o programa Statistical Package for the Social Sciences (SPSS). Resultados: Participaram do estudo 587 indivíduos, 42,8% eram enfermeiros e 57,2% técnicos ou auxiliares de enfermagem. A taxa de resposta atingiu 75,8% da população alvo. A maioria dos respondentes era do sexo feminino (88,4%), tinham entre 20 e 39 anos (60,8%), atuava na instituição há menos de cinco anos (57,8%) e não possuía outro vínculo de trabalho (79,2%). As dimensões caracterizadas como enfraquecidas nas instituições, foram: ‘’Apoio da gestão hospitalar para segurança do paciente’’ (48,5%), ‘’Percepções generalizadas sobre a segurança do paciente’’ (45,5%), ‘’Transferências internas e passagens de plantão’’(40,9%), ‘’Adequação de profissionais’’ (37,8%), ‘’Trabalho em equipe entre as unidades hospitalares’’ (37,0%), ‘’Abertura para as comunicações’’ (29,5%) e ‘’Respostas não punitivas aos erros’’ (18,8%). Sobre os indicadores de segurança do paciente, 52,5% dos profissionais consideraram a segurança do paciente como excelente ou muito boa, e 58,5% dos enfermeiros não notificaram ao menos um evento adverso em doze meses. Quanto aos fatores associados à percepção negativa, os profissionais que atuavam em unidades semicríticas do hospital 1 avaliaram negativamente com maior frequência a dimensão ‘’abertura para as comunicações’’ – RP: 1,246 (IC 95%: 1,007-1,540, p=0,042). Para a dimensão ‘’respostas não punitivas aos erros’’, os participantes do hospital 1 com mais de seis anos de atuação avaliaram negativamente com maior frequência quando comparados aos participantes com menos de seis anos – RP: 1,076 (IC 95%: 1,002-1,155, p=0,043). Ainda sobre a dimensão ‘’respostas não punitivas aos erros’’, os profissionais que atuavam em unidades semicríticas avaliaram negativamente com maior frequência quando comparados aos que atuavam em unidades críticas – RP: 1,639 (IC 95%: 1,282- 2,096, p <0,001) no hospital 2. Assim como os profissionais do gênero masculino no hospital 2 – RP: 1,538 (IC 95%: 1,198-1,975, p=0,001) e 3 – RP: 1,194 (IC 95%: 1,043-1,365, p=0,010). Conclusão: Conclui-se que há necessidade do apoio da alta gestão hospitalar frente à disseminação da cultura segurança do paciente, por meio de programas de sensibilização aos profissionais nas instituições, com incentivo a criação de uma cultura justa e não punitiva. Com isto os profissionais terão incentivo para notificarem os incidentes, e assim a alta gestão poderá trabalhar os incidentes de forma educativa.